過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建
基因過表達細胞株構(gòu)建服務(wù)包括目的基因過表達慢病毒載體構(gòu)建、病毒包裝、細胞轉(zhuǎn)染和篩選。您只需提供目的基因的cDNA質(zhì)粒或目的序列信息和需要構(gòu)建的細胞系，我們將按照您的要求完成目的基因過表達細胞株的構(gòu)建和檢測，提供給您高質(zhì)量的基因過表達穩(wěn)定細胞株。
服務(wù)特點
1、多種不同啟動子和標簽的慢病毒表達載體可供選擇。
2、采用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建，基因整合穩(wěn)定。
3、根據(jù)您的需要可以提供經(jīng)濟實惠的多克隆細胞系或者高品質(zhì)的單克隆細胞系。
您需提供的資料
1.客戶提供目的基因的序列，如果提供模板，請告知載體、酶切穩(wěn)點等信息；
2.若實驗材料為原代細胞或者特殊培養(yǎng)的細胞，請先咨詢；
3.公司默認提供病毒滴度為1x107-1x108TU/ml,規(guī)格1ml；
4.目的蛋白的功能驗證另外收費。
我們提交的內(nèi)容
1、實驗報告內(nèi)容：
A 慢病毒載體構(gòu)建報告及測序結(jié)果。
B 細胞篩選實驗報告。
C 目的基因表達檢測結(jié)果。
2、產(chǎn)品內(nèi)容：
A 已構(gòu)建慢病毒載體；
B 多克隆細胞系構(gòu)建服務(wù)提供目的基因過表達細胞株及EGFP表達對照細胞株各一株，單克隆細胞株構(gòu)建服務(wù)提供目的基因過表達單克隆細胞株2-3株及EGFP過表達對照細胞株一株。
原代細胞培養(yǎng)
將動物各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA) 或機械方法處理，分散成單細胞，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，麟美生物提原代培養(yǎng)服務(wù)供給您高質(zhì)量的原代細胞株。
服務(wù)特點
1、原代細胞分離培養(yǎng)與鑒定(鑒定可提供流式細胞儀檢測、免疫細胞化學(xué)、RT-PCR 、蛋白免疫印跡等多種方法檢測)。
2、細胞傳代代數(shù)低(一般4代)，細胞狀態(tài)好，無污染。
3、根據(jù)您的需要可以提供多種原代培養(yǎng)的細胞。
您需提供的資料
1、詳細說明進行原代細胞培養(yǎng)的組織，并確定組織是由客戶提供還是本公司提供。
2、盡可能提供該原代細胞的培養(yǎng)條件，或者由本公司摸索培養(yǎng)條件。
3、對于一些常見的原代培養(yǎng)組織，因為保存運輸?shù)牟槐憧赡軙档驮囵B(yǎng)的成功率，建議客戶選擇由本公司提供相應(yīng)的組織。
我們提交的內(nèi)容
提供凍存或處于對數(shù)生長期的細胞株一瓶(細胞培養(yǎng)條件，圖片)。
干細胞培養(yǎng)服務(wù)
提供廣泛的干細胞產(chǎn)品，覆蓋胚胎和誘導(dǎo)多能干細胞，神經(jīng)干細胞，間充質(zhì)干細胞（MSC），造血干細胞和癌癥干細胞等干細胞培養(yǎng)服務(wù)。
服務(wù)特點
1、干細胞分離培養(yǎng)與鑒定(鑒定可提供流式細胞儀檢測、免疫細胞化學(xué)、RT-PCR 、蛋白免疫印跡等多種方法檢測)。
2、細胞傳代代數(shù)低(一般4代)，細胞狀態(tài)好，無污染。
3、根據(jù)您的需要可以提供多種原代培養(yǎng)的細胞。
細胞增殖
一、流式熒光染色法
原理：
熒光染料CFSE， 即羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，這使得CFSE成為一種良好的細胞標記物。當細胞進行分裂增殖時，具有熒光的胞質(zhì)蛋白被平均分配到**代細胞中，這樣與**代細胞相比，其熒光強度便會減弱至一半；以此類推，分裂得到的第三代細胞的熒光強度便會比**代細胞再次減弱。這種現(xiàn)象可以在488nm的激發(fā)光下，采用流式細胞儀檢測分析，通過檢測到細胞熒光強度不斷的降低，進一步分析得出細胞分裂增殖的情況。
實驗步驟，以小鼠脾細胞為例：
1.取一只6-8周小鼠頸椎脫臼處死后，將其全部浸泡于75%酒精中；
2.在超凈工作臺上無菌取出小鼠脾臟；
3.用無菌注射器內(nèi)芯研磨脾臟，盡量不殘留較大組織塊；再用3mlPBS沖洗后，將脾臟研磨液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾至15mL離心管中，離心350g，5min；
4.棄上清后，加入2mL紅細胞裂解液，輕微吹打，裂解2min后加入等體積PBS終止裂解反應(yīng)，混勻后離心350g，5min；
5.棄上清，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀，并取10μL細胞液計數(shù)，將細胞濃度調(diào)至2.0×106/ml；
6.提前將CFSE按照說明書用DMSO配成5mM母液，并分裝儲存于-80冰箱，其工作濃度為0.5-25μM；
7、取部分細胞作為不染色組陰性對照，其他細胞加入CFSE溶液，使得終濃度為5μM，37°C避光孵育15min；
8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培養(yǎng)液，4℃，5min以中止染色；
9、棄上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培養(yǎng)液洗2次，*后用1640完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，充分吹打成單細胞懸液，將上述細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板,每孔105個細胞（陽性對照用PHA刺激）；
10、37℃，5%CO2培養(yǎng)3天后用流式細胞儀分析細胞488nm激光器檢查細胞增殖情況。
結(jié)果分析：用FlowJo分析細胞增殖
在FSC/SSC 上圈出目標細胞，使用 FSC-W/FSC-A 排除黏連體，使用 CFSE 單參看目標細胞的增殖情況。以下圖片來源于網(wǎng)絡(luò)：細胞攝取染料后，信號強，在右邊（不分裂的話，就是那個桃紅色的峰），隨著細胞的每一次分裂，細胞內(nèi)染料的濃度被稀釋一倍，信號也減弱一半，以此類推，由于細胞的分裂不同步，所以*后的結(jié)果是紅色的那些齒狀的峰。
實驗要點：
CFSE的濃度國外報道從0.5uM-20uM都有，建議終濃度為2.5-5uM。濃度太低，細胞標記的熒光強度不夠，太高了對細胞有毒性，且影響細胞增殖。標記孵育時要經(jīng)常搖勻。
二、CCK-8法
實驗原理：
CellCounting Kit-8（簡稱CCK-8）中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。
細胞周期
細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應(yīng)了細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等。
一、BrdU法
1、原理
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。
細胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小時）
2、儀器、用品與試劑
2.1、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)
2.2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
3、操作步驟
3.1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使*終濃度為10μg/ml。
3.2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3.3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
3.4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。
3.5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
3.6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
3.7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
3.8、鏡檢100個分裂相，計**、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。
3.9、計算：
（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉·2H2 O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。
附： （1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
二、PI染色檢測細胞周期
1、離心收集細胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細胞兩次。
2、加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定（4℃過夜一般隔天就進行檢測，如果想推遲幾天測，那就保存在-20℃，有資料說-20℃可以保存一個月，個人建議盡量在短時間內(nèi)檢測，有些實驗是在不同時間點上收細胞，這時我就等*后一次固定完了一塊測，基本上也多在一周內(nèi)檢測完畢，沒有特地去比較保存時間對檢測結(jié)果的影響）。
3、細胞染色
離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分鐘（PI我是直接用PBS配成工作濃度，然后加入細胞沉淀混勻，RNA酶現(xiàn)加，但有時不加發(fā)現(xiàn)對實驗結(jié)果也沒太大的影響） 。
4、流式分析
以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2-3萬個細胞，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。
分析時，使用FL2-w和FL2-A顯示，去除聯(lián)體細胞。
細胞周期流式后一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0期),而如果分析時細胞窗口沒設(shè)置好，可能在*前面還有細胞碎片峰。
結(jié)果解讀
G0/G1期細胞占總的61.2%，峰位于橫座標的45.76
G2/M期占13.07，峰位于橫座標的91.43
S期占25.73
G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細胞，而G1期為2倍體細胞，比值為2）
峰的變異系數(shù)為4.54%（好）
細胞碎片為0.48%，細胞聚集體有0.06%。
總的細胞數(shù)（儀器檢測到的）為17525個，
在細胞周期中分析的細胞數(shù)為17431個（即排除了碎片及聚集體后）
CV是變異系數(shù)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認可了。
細胞凋亡
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關(guān)。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
一、實驗步驟：
1. 凋亡細胞的制備
小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測細胞的濃度為2×106 /ml，備用。
2. 200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。
5. 加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。
6. 加入300 μl標記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）檢測。
二、注意事項：
1. 整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。
三、實驗結(jié)果
用熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細胞壞死中。以FITC標記的Annexin V, 可以同時結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。
RTCA實時監(jiān)測腫瘤細胞遷移及浸潤
細胞因子檢測
流式細胞檢測線粒體膜電位
激光共聚焦免疫熒光檢測
合肥合肥星肽生物科技有限公司 是致力于從事生命科學(xué)研究和提供高質(zhì)量的生物技術(shù)外包服務(wù)公司（CRO），主營多肽及小分子等化合物定制合成，同時還擁有自己開發(fā)的細胞株、菌株等產(chǎn)品，并承接相關(guān)的技術(shù)服務(wù)以及品牌（BIOLOGIX/巴羅克、DLAB/大龍）產(chǎn)品。
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天地合氣，萬物自生。
